V súčasnosti sme ešte stále svedkami nečakanej pandémie COVID-19, ktorú spôsobuje koronavírus SARS-CoV-2. 7. júna 2020 prekročil počet nakazených vo svete 7 milónov, ochoreniu podľahlo viac než 403 000 ľudí a uzdravilo sa viac než 3 440 000.
Pacienti s ochorením COVID-19majú rôzne príznaky – od miernych príznakov až po ťažký priebeh ochorenia. Tieto príznaky sa objavujú 2 až 14 dní po expozícii vírusu: horúčka, kašeľ, dýchavičnosť alebo ťažkosti s dýchaním, zimnica, triaška, bolesť svalov, bolesť hlavy, bolesť hrdla, strata chuti alebo čuchu. Popisuje sa aj zriedkavý výskyt hnačky (2 %) a nauzea a vracanie (1 %) (Chenetal., 2020).
80,9 % infekcií má mierny priebeh (s príznakmi podobnými chrípke) a môžu sa zotaviť doma.
13,8 % je závažných rozvíjajúcich sa chorôb vrátane zápalu pľúc a dýchavičnosti.
4,7 % infekcií sa vyskytujú ako kritické a zahŕňajú: zlyhanie dýchacích ciest, septický šok a zlyhanie viacerých orgánov.
Približne v 2 % hlásených prípadov je vírus smrteľný. Riziko smrti sa zvyšuje s vekom.
Medzi deťmi je zaznamenaných relatívne málo prípadov. V prospektívnej štúdii španielski autori popisujú u 375 prípadov kožné prejavy spojené s infekciou COVID-19. To môže pomôcť klinickým lekárom u pacientov s ochorením rozpoznať paucisymptomatické prípady, u ktorých je prítomných iba niekoľko príznakov (Casasetal., 2020).
Čo o novom koronavíruse vieme? Ako sme boli pripravení? Kde všade sme na Slovensku odoberali vzorky a testovali?
V priebehu ostatných 18 rokov vznikli dve epidémie, spôsobené SARS-CoV (2003) a MERS-CoV (2012),ako aj prebiehajúca pandémia spôsobená SARS-CoV-2 (2019 – 2020). Vírus SARS-CoV-2 je názorným príkladom toho, ako je dôležité venovať pozornosť zoonotickým vírusom, teda vírusom spoločným pre ľudí a zvieratá s najčastejším prenosom zo zvierat na ľudí.
Svetová zdravotnícka organizácia (WHO) označila ochorenie COVID-19, ktoré je spôsobené novým koronavírusom, za pandémiu.
Pandémia (gr. πανδημία zo slov pan, pantos = všetko, demos = národ, ľud) je rozsiahla epidémia, ktorá sa rozširuje na geograficky rozsiahlom území, dokonca medzi kontinentmi a celosvetovo. Aj pri pandémii sa môžu vyskytnúť ojedinelé oblasti, ktoré nie sú postihnuté: osamelé ostrovy, hlboké horské údolia, pralesy a iné. Naopak pôvodne nepostihnuté oblasti sa vďaka leteckej doprave nakazia. Je to dnes najväčšie nebezpečenstvo šírenia pandémií.
Nový koronavírus (na začiatku označovaný ako nCoV-2019)má názov SARS-CoV-2 a choroba, ktorú spôsobuje má názov COVID-19 (z anglického názvu COrona VIrus Disease 2019).
Všeobecné vlastnosti koronavírusov
SARS-CoV-2 patrí do čeľade Coronaviridae, rod Betacoronavirus. Genóm koronavírusov je nesegmentovaná pozitívne orientovaná RNA o dĺžke asi 30 000 nukleotidov (30 kb). Dve tretiny genómu koronavírusov kódujú 16 neštruktúrnych vírusových bielkovín, jedna tretina sa podieľa na syntéze štruktúrnych bielkovín. Okrem membránového (M), obalového (E) a nukleokapsidového (N) proteínu je najdôležitejším proteínom S glykoproteín, ktorý pri interakcii vírusu s bunkou zabezpečuje väzbu vírusu na bunkový receptor. S proteín je štiepený bunkovou furín-like proteázou na dve podjednotky S1 a S2. Podjednotka S1 obsahuje RBD (receptor binding domain – doména viažuca sa na receptor).
S2 tvorí stopku výčnelkov spike proteínu a zabezpečuje fúziu vírusu s bunkovou membránou.
6. 3. 2020 bola zverejnená správa o výskyte prvého prípadu na Slovensku: „Slovensko má potvrdený prvý prípad ochorenia COVID-19. Ide o 52 ročného pacienta, ktorý leží v Univerzitnej nemocnici Bratislava na Kramároch. Pacient nemá cestovateľskú anamnézu, čiže uplynulé dni nebol v žiadnej z krajín, kde sa koronavírus vyskytuje. Predpokladá sa, že v tomto prípade ide teda o sekundárny prenos. V zahraničí bol pred pár týždňami jeho syn, niekoľko dní strávil v talianskych Benátkach.“.
1. apríla 2020 vydáva Ministerstvo zdravotníctva Slovenskej republiky (MZ SR) „Odborné usmernenie v súvislosti s chorobou COVID-19 spôsobenou koronavírusom SARS-CoV-2 pre poskytovanie klinickej mikrobiológie mobilným odberným miestom (MOM)
z 1. apríla 2020“. Toto odborné usmernenie špecifikuje zriaďovanie, prevádzku a činnosť mobilného odberné - ho miesta (ďalej len „MOM“), personálne zabezpečenie MOM, materiálno-technické vybavenie MOM, odberové sety, odberový materiál, postup
pri odbere a transporte nasopharyngeálneho výteru, bezpečnosť MOM, využitie aplikácie Národného centra zdravotníckych informácií (NCZI), indikácie testovania a smerovanie pacienta po odbere.
Na základe tohto odborného usmernenia zriadil synlab slovakia s.r.o. najskôr tri mobilné odberné miesta, a to v Ilave, v Kráľovskom Chlmci a v Prešove v spolupráci s FNsP J.A.Reimana v Prešove. Koncom mája bolo zriadené aj MOM v Bratislave. Odborný tím tvoria erudované mikrobiologické laborantky v spolupráci s biochemickými laborantkami a vysokoškolskými pracovníkmi. Na MOM sa vykonáva odber priamo alebo z auta prítomnými zdravotníckymi pracovníkmi.
Išlo pre nás o úplne novú situáciu, kedy sa museli zháňať nedostatkové osobné ochranné pracovné prostriedky (OOPP) a zároveň sa museli preškoliť všetci členovia pracovného tímu MOM ako správne postupovať pri obliekaní a používaní OOPP a podobne aj pri vyzliekaní, dekontaminácii a likvidácii použitých OOPP.
Prvý deň prevádzky v MOM bol spustený 8. 4. 2020.
9. 4. 2020 vychádza aj tlačová správa, ktorú spracovala hovorkyňa Prešovskej nemocnice PhDr. Renáta Cenková, PhD., MBA v tomto znení:
Drive-through testovanie na COVID-19 aj pred prešovskou nemocnicou
Spoločnosť synlab slovakia s.r.o. v spolupráci s FNsP J. A Reimana Prešov zriadili mobilné odberové miesto (MOM), kde sa odoberajú vzorky pacientom podozrivým na ochorenie COVID-19.MOM je situované pred prešovským amfiteátrom (neďaleko hlavného vstupu do areálu FNsP Prešov).
MOM je označené nápisom COVID-19 a je pacientom k dispozícii v čase
medzi 8.00–13. 00. Odbery zabezpečuje kvalifikovaný a preškolený personál vybavený kompletnými osobnými ochrannými prostriedkami. Aby sa zamedzilo šíreniu potenciálneho prenosu, vzorky sa pacientom odoberajú priamo z motorového vozidla. Výsledky testov by mali byť pacientom (ošetrujúcim lekárom) oznámené do 48 hodín.
Pre koho je MOM drive-through určené?
- Pre pacientov, ktorých na vyšetrenie odošle lekár z oddelenia infektológie FNsP J. A. Reimana Prešov, a to na základe písomnej žiadanky.
- Pre pacientov, ktorým vyšetrenie indikuje všeobecný lekár, a to na základe písomnej žiadanky.
- Pre pacientov–samoplatcov, ktorí majú podozrenie na ochorenie (napr. pri stretnutí s osobou, ktorá javila známky ochorenia COVID-19, alebo s osobou
s pozitívnou cestovateľskou anamnézou a pod.), a to na základe objednania sa prostredníctvom online formulára.
Skríning pacientov v populácii
WHO odporúča vykonávať skríning u všetkých prípadov s podozrením na infekciu COVID-19. Podozrivé prípady sú definované ako:
A. pacienti s pozitívnou epidemiologickou anamnézou* a akútnym respiračným ochorením**;
B. pacienti so závažným akútnym respiračným ochorením vyžadujúcim hospitalizáciu, ktorí nemajú žiadnu inú diagnózu, ktorá by úplne vysvetlila klinické príznaky.
*Pozitívna epidemiologická anamnéza – v priebehu posledných 14 dní cestovateľská anamnéza, pobyt v mieste komunitného prenosu, kontakt s pravdepodobným alebo potvrdeným prípadom COVID-19.
**Akútne respiračné ochorenie – akútne respiračné ochorenie sprevádzané horúčkou a aspoň jedným respiračným príznakom (kašeľ alebo dýchavičnosť).
Metóda NAAT
Pre diagnostiku vírusu SARS-CoV-2 odporúča WHO priame stanovenie vírusovej RNA v odobratej vzorke pomocou amplifikačných testov (NAAT – Nucleic Acid Amplification Tests). Najpoužívanejšou metódou je rRT-PCR (Real-time reverse transcription polymerase chain reaction), to znamená PCR s reverznou transkripciou v reálnom čase, ktorá dokáže detegovať špecifické sekvencie vírusovej RNA. Konkrétne ide o detekciu génov E a RdRP. Validovaný diagnostický postup pre detekciu vírusu SARS-CoV-2 podľa WHO uvádza: a) prímárny skríning: detekcia génu E, b) potvrdzujúci skríning: detekcia génu RdRP.T.z. pozitívna detekcia jedného génu by mala byť potvrdená druhým rRT-PCR testom zameraným na iný gén vírusu SARS-CoV-2.
Detekcia SARS-CoV-2 s využitím real-time RT-PCR
Získanie sekvencie SARS-CoV-2 umožnilo rýchly vývoj špecifickej detekčnej metódy, ktorá sa dnes už masovo využíva na laboratórnu detekciu vírusu na celom svete, vrátane Slovenska. V súčasnosti najspoľahlivejším laboratórnym testom detekcie SARSCoV- 2 je real-time RT-PCR, pri ktorej sa vo vzorkách výterov z hrdla a nosa deteguje vírusová RNA. Metóda je veľmi citlivá, lebo dokáže zachytiť vírus už v raných fázach virémie. Aj keď je to relatívne jednoduchá metóda, vyskytuje sa však niekoľko kritických bodov, ktoré môžu spôsobovať falošne pozitívne či falošne negatívne výsledky.
Nepríjemným krokom je izolácia vírusovej RNA z klinickej vzorky. Tá sa najčastejšie robí na špeciálnych kolónkach s využitím magnetických častíc alebo extrakciou organickými rozpúšťadlami. Pri neskúsenosti experimentátora hrozia straty vyizolovanej RNA alebo kontaminácia vzoriek. Následný krok RT-PCR sa skladá z pridania jednotlivých reakčných zložiek zo súpravy, čo je pomerne jednoduché. Po namnožení DNA na veľké množstvá, čo sa deje automaticky v prístroji termocyklér (zabezpečuje naprogramovanú zmenu teploty reakčného roztoku), sa deteguje množstvo DNA v reálnom čase. Čím viac vírusu je vo vzorke, tým silnejší je registrovaný signál. Problémy nastavajú pri nízkej hladine vírusu vo vzorke, kedy sa ťažšie interpretujú výsledky, lebo sa pohybujeme v oblasti blízko detekčného limitu metódy. Existujú a sú popísané preanalytické a analytické faktory, ktoré môžu ovplyvniť diagnostické testovanie infekcie COVID-19: (L i p p i et al., 2020).
Preanalytické faktory:
- Chýbajúca alebo nesprávna identifikácia,
- neprimeraný odber vzoriek,manipulácia, transport a skladovanie,
- nekvalitný odber alebo nedostatočný objem,
- prítomnosť interferujúcich látok,
- chyby manuálneho pipetovania,
- kontaminácia vzorky,
- testovanie pacientov užívajúcich antivírusovú terapiu.
Analytické faktory:
- Testovanie vykonané v dg.okne,
- aktívna vírusová rekombinácia,
- použitie nedostatočne validovaných testov,
- nedostatočná harmonizácia primerov a sond,
- porucha prístroja,
- nevhodnosť alebo nedostatok materiálu,
- nešpecifický PCR signál,
- chybná interpretácia (of expression profiles).
Čísla a fakty PCR Košice – štandardný mód
Mikrobiologické laboratórium v Košiciach vyšetrí približne 6500 biologických materiálov ročne, prevažná väčšina sú urogenitálne stery na sexuálne prenosné ochorenia (STD) mimo nich herpetické vírusy, hepatitídy kvalitatívne a kvantitatívne stanovenia + špeciálne vyšetrenia ako Bactoplex, Pneumoplex, Fungiplex, SEPSA panel a pod.
Tejto oblasti sa venujú dvaja pracovnici, jeden vysokoškolský a ďalší stredoškolský pracovník v prevádzkovej dobe pondelok až piatok od 7.00 hod. do 15.30 hod.
Prístrojové vybavenie na testovanie nového koronavírusu pozostáva z troch PCR, dvoch RT- PCR,
1 x Izolátor NK, termobloky, trepačky. Manifold…
V akom chronologickom postupe sa zriaďovalo „nové“ laboratórium určené pre testovanie SARS-CoV-2?
- 10. 3. 2020 Prvá požiadavka na realizáciu (preverenie možnosti diagnostiky v košickom PCR laboratóriu)
- 17.3. 2020 Realizovaný presun laminárneho boxu + reorganizácia, pristroj PCR laboratória + validácia laminárneho boxu 19. 3. 2020 Dodávka mraziaceho boxu (–80 °C)
- 9. 3. 2020 Realizovaná prestavba vzduchotechniky (samostatný odťah z laminárneho boxu + úprava prívodu vzduchu do izolačnej miestnosti)
- 20. 3. 2020 validácia mraziaceho a laminárneho boxu ukončená priestorová fáza
- 23. 3. 2020 prvý test diagnostík a izolácie
- 24. 3. 2020 test referenčného materiálu UNLP – „Univerzitná nemocnica L. Pasteura“ (potvrdená pozitívna vzorka)
- 25. 3. 2020 plánovaná kapacita 200 vzoriek denne (realizované objednávky 3 druhov diagnostík na amplifikáciu BIOVENDOR, SIEMENS, EUROLAB) a 5 druhov izolácií (ROCHE, JENA, LABO, CAV PRAHA, I.T.A)
- 26. 3. 2020 test referenčného materiálu NRC (Národné referenčné centrum) Bratislava (potvrdené pozitívne 3 vzorky)
- 28. 3. 2020 realizované prvé reálne vyšetrenia ÚVZ SR (Úrad verejného zdravotníctva Slovenskej republiky) Bratislava – 5 vzoriek, z toho 1 pozitívna
- 1. 4. 2020 RNDr. Rastislav Mucha, PhD. posila na PCR (vyhodnocovanie)
- 8. 4. 2020 inštalácia izolátora JENA Analytik (kapacita 400 vzoriek denne)
- 25. 4. 2020 2. pozitívna vzorka konfirmáciu (konfirmácia NRC Bratislava)
- 26. 4. 2020 3. pozitívna vzorka na konfirmáciu (konfirmácia NRC Bratislava)
- 27.4. 2020 tím na zapisovanie vzoriek (laborantka + dvaja „brigádnici“)
- 5. 2020 zaslané posledné pozitívne vzorky v počte 2, konfirmácia v NRC Bratislava ukončená
- 4. 5. 2020 RNDr. Ján Košuth, PhD. posila na PCR (vyhodnocovanie)
- 5. 5. 2020 realizovaný QCMD porovnávací test (externá kontrola kvality) (priebežne výsledky 8 vzoriek vykazujú 100 % zhodu)
- 7. 5. 2020 inštalácia RT- PCR cyklera Biorad CFX 96.
V čase najväčšieho náporu vzoriek v laboratóriu pracuje na testovaní koronavírusu 11 pracovníkov, z toho 3 VŠ, 5 SŠ + 3 pracovníci na príjme vzoriek. Pracovná doba bola takmer nepretržitá od 7.00–1.30celý týždeň od pondelka do nedele. Prístrojové vybavenie na testovanie nového koronavírusu tvoria 2 RTPCR (nový Biorad), 2 izolátory (nový Jena).
Tých vyššie uvedených devätnásť bodov, ktoré nezabralo ani pol strany, si v skutočnosti vyžadovalo veľké nasadenie, veľa energie, entuziazmus, poctivý – mnohokrát až nadľudský prístup, neúnavné testovanie vhodných kontrolných vzoriek, až kým sa nezačalo s testovaním reálnych vzoriek pacientov. Vymenovávať všetkých členov tímu by neprinieslo taký efekt, ako keď všetci, ktorí boli alebo sa do uvedeného procesu zapojili, vedia, že o nich je reč a robili to s láskou ku svojmu povolaniu a odovzdaní celým srdcom pre zmysluplnú prácu. To, že tieto slová sú pravdivé svedčia aj výsledky testovania za mesiace apríl, máj, až po súčasnosť (viz tabulka).
Vyšetrenie protilátok
Sérologické testy stanovujúce protilátky proti vírusu SARS-CoV-2 nie sú v súčasnej dobe odporúčané na diagnostiku COVID-19. Dôvodom je ich limitovaná výpovedná hodnota v akútnej fáze infekcie, pretože protilátky vznikajú až po určitej dobe po nákaze (obvykle 7–10 dní). Naviac, niektoré sérologické testy môžu skrížene reagovať s protilátkovou odpoveďou na iné sezónne koronavírusy. Koncentrácie IgM sú detegovateľné za 10 dní od nástupu symptómov a koncentrácie IgG za 12 dní (Padoanetal., 2020).
Bude sa SARS-CoV-2 detegovať v slinách?
Sliny sa ukazujú ako perspektívny klinický materiál na detekciu SARS-CoV-2. Odber slín je naviac nielen vhodnejší pre pacienta, lebo je menej invazívny, ale aj preto, že sa môže vykonávať bez potreby vyškolených odborníkov a veľkých ochranných opatrení (A z z i et al., 2020).
Americký úrad pre kontrolu potravín a liekov (U. S. Food and Drug Administration) už schválil sliny ako vhodný materiál na detekciu SARS-CoV-2 testomRT-PCR. Nasleduje proces validácie testu a jeho rýchle zavedenie do diagnostickej praxe.
V súvislosti s využitím slín na detekciu nebezpečného vírusu je tiež užitočné si uvedomiť, že pri rozprávaní uvoľňujeme do prostredia aj aerosól slín. Rúška, ktoré bránia jeho rozptýleniu do priestoru, preto výrazne znižujú šírenie vírusu do okolia. Nákazu COVID-19 sa nám podarilo dostať pod kontrolu, ale ešte sme úplne nevyhrali. Stále sa môžeme nakaziť.
Literatúra
- Chen, N. et al. (2020): Epidemiological and clinical characteristics of 99 cases of 2019 novel coronavirus pneumonia in Wuhan, China: a descriptive study. The Lancet, 2020; 395(10223):507-513.
- Casas G.C. et al. (2020): Classification of the cutaneous manifestations of COVID-19:a rapid prospective nationwide consensus study in Spain with 375 cases. British Journal of Dermatology (IF 6.714)Pub Date : 2020-04-29.
- WHO guide for Global surveillance for COVID-19 caused by human infection with COVID-19 virus: interim guidance, 20 March 2020.
- Lippi G. et al. (2020):Potential preanalytical and analytical vulnerabilities in the laboratory diagnosis of coronavirus disease 2019 (COVID-19).Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM) 2020 Mar 16;1(ahead-of-print). PMID: 32172228.
- Padoan A. et al. (2020): Analytical performances of a chemiluminescence immunoassay for SARS-CoV-2 IgM/IgG and antibody kinetics. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 2020 Apr 16;1(ahead-ofprint). PMID: 32301749.
- Azzi L. et al. (2020): SALIVA IS A RELIABLE TOOL TO DETECT SARS-CoV-2. Journal of
Autor:
MUDr. Hedviga Pivovarníková