Když zazní termín mikrobiologie, bude mít většina lidí, které okolo sebe běžně potkáváme pocit, že ví přesně o co jde. Položme si však otázku, zda je tomu skutečně tak? Pokud zabrousíme do hodin středoškolské biologie jistě se nám vybaví definice, že mikrobiologie je biologický obor (Termín mikrobiologie pochází z řeckého slova micron = malý, biologia = studium života) zabývající se mikroskopickými organizmy, které nelze pozorovat pouhým okem. Do této skupiny patří několik skupin organizmů, nejznámější jsou bakterie a viry, která známe především jako původce infekčních chorob člověka, živočichů i rostlin. Ovšem také se nám vybaví skutečnost, že řada těchto mikroorganizmů má pro fungování lidského těla enormní význam, ba co víc, tělo bez těchto mikroorganizmů nemůže fungovat. Většina mikroorganizmů je tedy pro člověka prospěšná a od samého počátku fungují tyto dva buněčné typy v symbióze, nicméně je třeba si uvědomit, že malá část těchto mikroorganizmů je pro člověka patogenní, a právě touto skupinou se zabývá lékařská mikrobiologie, která diagnostikuje a studuje převážně mikroby, které vyvolávají u člověka nějaké více či méně specifické onemocnění (tzv. patogeny). Ač si to mnozí z nás vůbec neuvědomují tak až 50 % pacientů, kteří zemřou v nemocnici umírá na infekční komplikace, nikoliv na primární diagnózu. Dle statistik je sepse jednou z nejčastějších příčin úmrtí ve vyspělém světě. Je až nepochopitelné, že nemoci spojené se zdravotní péčí (kam patří nazokominální infekce) představují značné náklady a dle dat WHO je to 7 miliard € v Evropě, a 6,1 miliard $ v USA.
Mikrobiologové nepracují pouze s jedním organismem, ale s mnoha miliony organismů, které jsou získávány kultivací v přísných laboratorních podmínkách. Mikroorganismy jsou pěstovány v živných prostředích v tzv. živné půdě. Složení půdy je pokaždé jiné, vždy závisí na účelu. Nicméně je třeba si uvědomit, že tento způsob již není dostačující a je pouze počátkem další identifikace. A to z celé řady důvodů. Nejde již jen o to přijmout vzorek a vydat nějaký výsledek, ale zhodnotit, zda je mikroorganismus identifikovaný ve vzorku reálným vyvolavatelem infekce, dále jít ještě na nižší úroveň, a to nejen na úroveň proteinů v podobě antigenů atd., ale na úroveň molekul, a to molekul základních, v podobě nukleových kyselin a mikroorganizmus subtypizovat na této úrovni. Jednoduše řečeno, v procesu identifikace se analyzují vlastnosti vykultivovaných mikroorganismů s použitím široké škály fenotypových a genotypových metod. Díky tomu tak lze pečlivě zvážit, které antimikrobní preparáty doporučit pro léčbu či správně aplikovat antivirotikum např. v případě infekce HCV. Umožňuje tak spolupracujícím lékařům úspěšně léčit bez oněch zmiňovaných zbytečně vysokých nákladů ověřenými základními antibiotiky a bez výraznějších vedlejších účinků, s dosažením cíleného efektu. Z toho plyne, že součástí lékařské mikrobiologie jsou také antibiotická konzilia a řešení klinických či epidemiologických situací. Dávat odbornou a myšlenkovou nadstavbu laboratorní práci je smyslem i posláním práce lékařského mikrobiologa. Tento přístup vede k rozšíření obzorů, ke zvýšené motivaci a dost často také k odstranění rutiny.
Toho by však nebylo dosaženo bez aplikace nových diagnostických postupů. Je třeba si uvědomit, že základem moderní mikrobiologické diagnostiky jsou stále kultivační metody, ale i tyto metody podléhají neustálému pokroku a zlepšování, a to nejen v podobě například selektivních, slektivně-diagnostických a chromogenních půd, ale hlavně v zavádění automatických systémů a v poslední době velkým hitem analýzy obrazu tzv. digital mikrobiology. Dalším krokem bylo zavedení molekulárně-biologických metod, které otevřeli nové možnosti v mikrobiologické diagnostice. Jedná se především o amplifikační metody, mikročipy a v poslední době také sekvenační metody. S rozvojem vysoce sofistikovaných sekvenačních metod, jako je NGS se nám otevírají další možnosti v podobě například studia střevního mikrobiomu atd. Další možností modernizace mikrobiologické diagnostiky jsou funkční metody, kam patří speciální mikroskopické techniky, průtoková cytometrie a hmotnostní spektrometrie. Právě poslední zmíněná technika, je velkým průlomem, který může zlepšit mikrobiologickou diagnostiku v mnoha laboratořích a být velkým pomocníkem rutinního diagnostického pracovníka. Důležitým kritériem v celém diagnostickém procesu je totiž rychlost, za kterou se dospěje ke klinicky validnímu výsledku. Především u těžkých či vzácných infekcí a septických stavů, může včasný výsledek ovlivnit osud pacienta. Proto se hledají možnosti, jak urychlit a zpřesnit mikrobiologickou diagnostiku. Takovou technologií je právě zmíněná metoda hmotnostní spektrometrie neboli MALDI TOF (Matrix Assisted Desorption Ionization – Time of Flight). Jistě se na tomto místě sluší nejprve zmínit jména K. Tanaka a J. B. Fenn, která jsou spojena s touto technologií za, kterou oba vědci obdrželi v roce 2002 Nobelovu cenu za chemii. V rámci laboratoří synlab czech je tato vysoce sofistikovaná technologie využívána v její největší mikrobiologické laboratoři laboratoř Praha, CUBE na Evropské a původní přístroj této laboratoře, který byl nahrazen novým, ještě výkonnějším, teď rozšířil diagnostické portfolio mikrobiologické laboratoře v Chomutově.
Důvodem, proč mikrobiologické laboratoře společnosti synlab využívají tuto metodu je snaha o vysokou spolehlivost a přesnost v druhové identifikaci a významné zkrácení času nutného k vydání výsledku, což je prioritou naší laboratoře. Velkým přínosem je tato metoda v diagnostice všech původců infekčních nemocí způsobených jak nemocničními, tak komunitními patogeny. Spektrum patogenů je velice široké, zahrnující pomalu rostoucí anaerobní patogeny, dále nutričně náročné patogeny, patogeny vyvolávající střevní infekce, kam patří hlavně v letním období salmonely, kampylobaktery, yersinie, respirační patogeny, mezi něž patří hemofily, streptokoky, patogeny způsobující uroinfekce, infekce genitálního aparátu, ale i kvasinek a plísní, možná je také identifikace vzorků zvířat či stěrů z prostředí. Za zmínku stojí také možnost využití pro detekci některých mechanismů rezistence (průkaz karbapenemáz), ev. pro přímou identifikaci z hemokultur.
Principem metody MALDI TOF je stanovení molekulové hmotnosti zkoumaného vzorku ionizací laserem za přítomnosti matrice v kombinaci s detekcí doby letu. Matricí, která slouží jako rozpouštědlo, je kyselina skořicová a samotná příprava vzorku je velice jednoduchá a spočívá v přenesení malé části kolonie například pomocí párátka na destičku, kde dojde k přidání kyseliny skořicové, která vyextrahuje jednotlivé proteiny, důležité k následnému měření. Poté se nechá vzorek zaschnout a pracovní destičku lze vložit do přístroje. Směs matrice a vzorku na nosiči je zasažena nanosekundovým pulzem laseru, přičemž dojde k ionizaci molekul vzorku. Vzniklé ionty jsou urychleny silným elektrickým polem a proletí trubicí detektoru rychlostí úměrnou jejich hmotnosti a náboji. Zaznamenává se celková doba letu částic od aplikace laseru po dopad na detekční destičku. Výsledkem celého procesu je hmotové spektrum, které je druhově specifické pro jednotlivé mikroorganismy. Naměřené spektrum se následně srovnává s profily v referenční databázi a vyhodnotí se.
Naše laboratoř disponuje novým přístrojem MALDI Biotyper Microflex LT SH Smart od americké firmy Bruker Daltonics, který díky svým parametrům dokáže výsledek vyhodnotit ještě lépe a rychleji než jeho předchůdci. MALDI Biotyper Microflex LT SH Smart poskytuje ve srovnání s předešlými přístroji více než třínásobně rychlejší získání požadovaných hmotnostních spekter vzorku. Ta jsou porovnávána se spektry referenčními, uloženými v knihovnách vyhodnocovacího softwaru. Získaný výsledek je interpretován sestupně dle skóre v limitu 0–3, kde nejvyšší hodnota označuje nejlepší shodu s referenčním vzorkem. MALDI Biotyper Microflex LT SH Smart zvládne analýzu během několika minut, má tedy obrovský přínos pro provoz laboratoře i samotného pacienta. Nová verze přístroje MALDI-TOF vyniká především extra výkonným laserem, který dokáže vydat až 200 výstřelů na jeden vzorek za sekundu. Dále knihovnou IVD extended library, která je obsažena v softwaru přístroje, a kromě běžných patogenů obsahuje oproti předchůdcům i mnohá další spektra. V neposlední řadě rychlejší pumpou na odčerpání vzduchu z komory – vzorek je analyzován ve vakuu.
Jako u každé metody, i zde najdeme nějaké mouchy. V některých konkrétních případech, nelze provést přesnou identifikaci. Nejedná se ovšem o limitaci metody MALDI-TOF, ale důvodem je genetická příbuznost některých rodů kdy, nelze provést přesnou druhovou identifikaci, jako například u streptokoků a také u rodů Shigella a Escherichia, tady je ovšem nutné dodat, že v původní nomenklatuře se jednalo o jeden rod. V těchto ojedinělých případech je pak nutné volit alternativní diagnostický postup, v naší laboratoři se jedná o přístroj VITEK.
Jak je patrno, například v případě E. coli/Schygella může mít MALDI-TOF své potíže, na druhou stranu se dá ještě i ledacos vylepšit či urychlit, jako je tomu v případě S. enteritidis. MALDI-TOF generuje charakteristická proteinová spektra, unikátní pro každý mikroorganizmus tzv. fingerprinty. Identifikace porovnáváním fingerprintů je u salmonel dostačující pouze na identifikaci rodu. Výjimku ovšem může tvořit detekce specifické biomarkerové molekuly nejčastěji se vyskytujícího sérovaru S. enteritidis, jako velice rychlé diagnostiky tohoto mikroorganizmu. Pro tento sérovar byl nalezený unikátní signál v oblasti m/z 6036, který odpovídá zatím nespecifickému proteinu. Na identifikaci Salmonella Enteritidis pomocí MALDI TOF je možné využít přítomnost tohoto specifického biomarkeru, kdy je uváděna až 100% specificita a 95% senzitivita. Metoda je jednoduchá, vhodná do klinických mikrobiologických laboratoří, kde urychlí diagnostiku, a sníží náklady.
Naše laboratoř provedla paralelní testování více jak tří set vzorků salmonel, kdy byla k výsledku MALDI-TOF provedena následná aglutinace a byla prokázána 100% shoda. Díky tomuto výsledku mohla být tato rychlá diagnostika S. enteritidis zavedena do rutinní praxe naší laboratoře, která ročně provádí více jak tisíc detekcí a tím zkrácení času do uvolnění výsledku a snížení nákladů.
Obr. 1. Unikátní signál v oblasti m/z 6036, který odpovídá zatím nespecifickému proteinu u Salmonella Enteritidis detekovaný pomocí MALDI TOF
Jak je tedy patrno, tato technologie je nejen skvělý pomocník, ale i velký přínos pro diagnostiku a pacienta. Naše laboratoř identifikaci pomocí MALDI-TOF využívá velice masívně a ročně je provedeno cca desetitisíce identifikací.
Nový přístroj lze využít v rámci služeb laboratoře CUBE. Provozní doba laboratoře je od pondělí do pátku od 7 do 18 hodin, v sobotu od 7 do 16:30 a v neděli od 8 do 12 hodin.
Autoři:
RNDr. Ing. Libor Staněk, PCTM
MUDr. Filip Prusík
Laboratoř CUBE, Evropská 178, Praha
